Впервые Николай Засухин вышел на сцену в трёхлетнем возрасте вместе с родителями, игравшими в самодеятельном спектакле. На годы Великой Отечественной войны пришлась его служба в армии, после которой Н. Засухин поступил в театральную студию при Куйбышевском драматическом театре (окончил в 1948 году). Начав работать во вспомогательном составе театра ещё во время учебы, с 1946 года он – артист Куйбышевского театра драмы. Первой значительной ролью Н. Засухина на профессиональной сцене была роль молодого офицера госбезопасности Быстрова в пьесе «Тайная война» братьев Тур, которая была поставлена в 1950 году.
За 26 лет им сыграно немало ролей, среди которых: Гоша («Чудесный сплав» В.М. Киршона, 1956), Геннадий («В поисках радости» В.С. Розова, 1957), Борис Прищепин («Когда цветёт акация» Н.Г. Винникова, 1957), Али («Интервенция» Л.И. Славина, 1957), Патлай («Трасса» И.М. Дворецкого, 1959), Виктор («Иркутская история» А.Н. Арбузова, 1960), Отелло («Отелло» У. Шекспира, 1964), Устин Морозов («Тени исчезают в полдень» А.С. Иванова, 1965), Ганнибал «Странная миссис Сэвидж» Дж. Патрика, 1967), В.И. Ленин («Шестое июля» М.Ф. Шатрова, 1967), Князь Мышкин («Настасья Филипповна» по Ф.М. Достоевскому, 1971), Миндаугас («Миндаугас» Ю. Марцинкявичюса, 1972) и другие.
Наиболее значительные образы артист создал в горьковском репертуаре: Пётр Артамонов («Дело Артамоновых», 1959), Павел Власов («Мать», 1963), Фома Гордеев («Фома Гордеев», 1968). Эти роли, как и роль Ричарда III в одноимённой трагедии Шекспира (1962), стали высшими сценическими достижениями актёра.
Манере Николая Засухина были присущи темперамент, мягкий юмор, стремление к внутреннему перевоплощению, пластичность и острый рисунок роли. Он был характерным актёром, актёром, для которого трудность задачи была стимулом творчества и во многом – залогом успеха. Совсем молодым он сыграл старика Силана в «Горячем сердце» А.Н. Островского. А в роли Петра Артамонова надо было прожить целую жизнь, преображаясь, меняясь на глазах зрителя.
Многие были удивлены, когда Пётр Львович Монастырский на роль Ричарда III назначил Засухина, но решение режиссёра оказалось счастливым моментом в судьбах и его самого, и актёра. В многочисленных рецензиях, опубликованных в это время в различных изданиях, отмечалась незаурядная работа артиста. Вот что писал Борис Евгеньевич Захава: «Артист не «рвёт страсти в клочки», он играет неторопливо, вдумчиво, сосредоточенно. С удивительным артистическим спокойствием, с великолепным самообладанием плетёт он сложный сценический рисунок роли… Роль Ричарда удалась Засухину уже сейчас, и я не сомневаюсь, что он сможет сделать её ещё более интересной».
В своей книге «Мой театр» Пётр Монастырский рассказывал: «Вспоминая манеру существования этого артиста в театре, я с уверенностью могу сказать, что для него не было понятия «маленькая» роль, роль «без ниточки». Он умел увлечься самим материалом, его вторым планом, его подтекстом. Он горячо, заинтересованно принимал подсказки режиссёра, и вскоре вырисовывался образ… Мы учились друг у друга. Мы учили друг друга».
С 1972 по 1992 годы Николай Засухин был артистом МХАТа им. М. Горького. Снимался в художественных фильмах «Свой среди чужих, чужой среди своих» (режиссёр Н. Михалков), «Комитет девятнадцати» (режиссёр С. Кулиш), «Твой современник» (режиссёр Ю. Райзман) и других.
Один из сюжетов фильма Куйбышевской студии кинохроники «Провинциальные актёры» (режиссёр Б. Свойский, 1993) был посвящён Николаю Засухину.